Cas9 KO | Cas9 KO

  • 1Q:如何查找基因序列并确认exon位置?
  • A:进入网站:http://www.ensembl.org/index.html?redirect=no,下拉选择Mouse,输入基因名称(以基因Nlrp3为例)进行查询。

    进如界面:

    选择Nlrp3 (Mouse Gene, Strain: reference (CL57BL6)),点击进入:

    左侧Gene-based displays下点击Sequence 点击Download sequenceRTFDownload,即下载到该基因的序列,红色背景为exon序列。

  • 2Q:鉴定结果中,为什么founder鼠存在多种突变形式?
  • Afounder鼠是显微注射的直接结果,cas9发挥作用可能发生在受精卵分裂后,因此对于同一只鼠而言,cas9对基因的切割会存在不同的形式。

  • 3Q:获得了鉴定成功的某种基因敲除形式的founder,是否一定能够通过founder繁育获得相应的F1代?
  • A:不一定。鉴定founder时是鉴定的体细胞,而founder中的某种突变是否进入到生殖细胞中尚未可知。从我们的结果看,在founder中鉴定到基因敲除形式能遗传至下一代的概率较高。

  • 4Q:为什么会出现founder中鉴定结果中没有的基因突变形式?
  • Afounder鼠是显微注射的直接结果,cas9发挥作用可能发生在受精卵分裂后,因此对于同一只鼠而言,cas9对基因的切割会存在不同的形式。我们鉴定时采用挑克隆的方式,就导致了鉴定结果可能存在不完整的后果,这也是无法避免的,但只要founder中存在KO阳性,我们即认为该founderKO阳性。

  • 5Q:拿到小鼠后与什么鼠进行交配繁育?
  • Acas9 KO的小鼠来源是B6J,因此拿到的小鼠不论是founder还是F1都应该与B6J交配获得后代。

  • 6Q:繁育得到的小鼠如何鉴定?
  • A

    1. 如果基因缺失片段较大(缺失大小占PCR产物的20%以上),用鉴定报告中提供的引物进行扩增,琼脂糖凝胶电泳即可区分,只存在WT条带的为WT鼠,存在WTKO条带的为杂合鼠(+/-;
    2. 如果基因缺失片段较小(缺失大小占PCR产物的20%以内),则用鉴定报告中提供的引物进行扩增后将扩增产物测序。如果测序结果的峰图没有出现套峰,且与该基因比对无差异的为WT;如果测序结果的峰图从中间开始出现套峰,那么需要读取序列信息,方法如下:

    以某测序结果为例:

    WT的基因序列为CTTCGGCGGCGCCCAGGA

    红色字体部分的测序结果是套峰,表示序列从这里开始缺失,其中一个峰是WT的,另一个峰就是KO的,可以通过峰的颜色进行判断碱基的类型,从图上看从色部分KO的序列是:TACGCGGCGCC,此序列在WT序列中是可以查找到的,蓝色序列(WT)与绿色序列(KO)之间的就是缺失序列。(备注:也可能出现插入碱基的情况,可通过多读取一些绿色序列(KO),KO序列的前段部分就是插入序列,一般只有几个)

  • 7Q:拿到不同line的F1小鼠怎么办?
  • AF1小鼠是founderB6J交配的后代,基因型已经确认,是杂合鼠(+/-)。不同的line为不同的基因缺失方式,应该分开繁育,不能混淆。

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