ES细胞 | ES cell

  • 1Q: 何为Knockout First(KO First)?
  • A:

    Knockout First (KO First)打靶策略不同于一般的敲除设计,能实现多用途的基因敲除。在靶片段(Critical Region)的两侧放置方向相同的loxp位点,同时在靶片段5’端内含子中放置一个两侧带有FRT位点的SA-IRES-lacZ片段,含有Splice acceptor(SA),核糖体结合位点 IRES,报告基因lacZ和抗性筛选标记Neo。其基因转录会在SA的作用下改变,转录出lacZ的部分,并在polyA处终止,因此其最初是一个不表达的状态,并且可以用靶基因的启动子表达报告基因(lacZ),通过检测报告基因的表达即可了解靶基因的表达情况。与表达Flp的工具鼠交配后可去除SA-IRES-lacZ片段,得到常规的flox小鼠 ,从而还原已敲除基因的表达,获得基因条件性敲除小鼠,与不同组织特异性的Cre交配后即可用于更精细的研究。

    KO First打靶载体示意图如下:

     

  • 2Q:Conditional ready和Targeted Non-conditional的区别?
  • A:

    KO First载体正确打靶后得到的就是Conditional ready的ES细胞,是具有成为条件性打靶潜力的,但是,在打靶载体发生同源重组时,有时会错误的发生在载体中的Critical Region部分,位于打靶载体3’远端的loxp就会因此丢失。

    这种情况称为Targeted,Non-conditional,其最远端的loxp缺失,lacZ仍可以标示基因表达情况, 并且在大部分情况下仍能够破坏基因表达,但是在Flp重组后无法转换成条件性敲除的形式。

     

  • 3Q:如何查询KO first打靶后的序列信息和示意图?
  • A:

    可以直接由中心首页(https://www.cam-su.org/)的资源库检索界面按基因名及MGI号进行检索,

    找到基因后点击 查看详细的克隆信息(  代表已有QC结果)

    我们展示细胞克隆的打靶载体示意图,并提供序列下载。

     

  • 4Q:如何下载某基因的序列信息?
  • A:

    登录NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),下拉选择Gene,输入基因名称(以Acat3为例),点击search进行查询

    查询结果如下:

    Name/Gene ID下方选择点击Acat3进入,并找到Genomic regions,transcripts,and products项目,点击选择下方的Genebank:

    点击Genebank进入后即可下载该基因的序列信息。

  • 5Q:图谱中的Frt是什么作用?是构建筛选ES细胞用的么?
  • A: FRT位点可以配合Flipase,和Flper小鼠(表达flipase)进行交配,去掉两个FRT位点之间的元件之后,可以转变为Exon被两个loxp位点包围的条件性敲除小鼠,把小鼠从全敲转变为条件性敲除。

     

  • 6Q:如何挑选ES细胞克隆?
  • A: 您可以登录(https://www.mousephenotype.org/imits/targ_rep)查询更详细的信息以挑选合适的克隆。如果您对如何挑选克隆不是非常清楚,可以直接用基因名下单,我们会向您推荐克隆。基于本中心已完成克隆的QC通过率,我们推荐选择3个克隆,以获得更好的项目完成度。

     

  • 7Q:为什么ES细胞需要进行Quality Control(QC),QC检测的是什么?
  • A:

    QC的目的在于从细胞水平上尽量提高能够获得正确敲除小鼠的概率。我们会检测 lacZ,loxps(loxp1-3,取决于具体的载体)这几个重要的位点,5’LA和3’LA鉴定来确认载体是否正确整合到目标位置。另外会检测4条染色体,Chr8、ChrY、Chr1和 Chr11的拷贝数(copy number),这四条染色体拷贝数对ES细胞GLT效率有极大影响 。

     

  • 8Q:如何解读Copy Number的结果?
  • A: Copy number的检测是通过荧光定量的方法,以野生型的ES细胞作为对照,使用特定的探针对待检测的几条染色体进行拷贝数定量。正常情况下,常染色体拷贝数为2,性染色体拷贝数为1。根据IKMC及我们之前的经验,染色体拷贝数的异常,会大大降低ES细胞进入生殖系遗传到后代的几率,特别是Chr1,8,11,Y四条染色体。一般优先使用Copy数全部通过的克隆(通过标准,Chr1,8,11在1.6-2.4之间,ChrY在0.8-1.2之间)。

     

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