ES细胞 | ES cell

  • 1Q: 何为knockout first(Conditional ready&Targeted Non-conditional)?
  • A:International Knockout Mouse Consortium(IKMC)定义的knockout-first (KO First)等位基因的最初状态是一个不表达的状态(即基因敲除),不是条件性打靶的等位基因。knockout first是一种多用途的基因敲除模型,与条件敲除策略类似,在靶片段的两侧分别放置方向相同的loxp位点,同时还在靶片段5’端内含子中放置一个两侧带有FRT位点的SA-IRES-reporter片段,含有Splice acceptor(SA),报告基因和Neo。这样的模型可以用靶基因的启动子表达报告基因(reporter),通过检测报告基因的表达即可了解靶基因的表达情况;得到的小鼠是目的基因敲除同时敲入报告基因与抗性基因的小鼠。与表达Flp的工具鼠交配可去除SA-IRES-reproter片段,得到常规的flox小鼠,从而还原已敲除基因的表达,获得基因条件性敲除小鼠。而flox小鼠与各种组织特异的Cre工具鼠交配即可得到各种条件型敲除模型。

  • 2Q:Conditional ready和Targeted Non-conditional的区别?
  • A:KO first载体正确打靶后得到的就是Conditional ready的ES细胞,是可以具有成为条件性打靶潜力的,打靶示意图如下:

    但是,在打靶载体发生同源重组时,有时会错误的发生在载体中的critical region部分,位于打靶载体3’远端的loxp就会因此丢失,打靶示意图如下:

    这种情况称为Targeted Non-conditional,最远端的loxp缺失,lacZ仍可以标示基因表达情况,并且在大部分情况下能够破坏基因表达,但是在与flp重组后无法转换成条件性敲除的形式。

     

  • 3Q:如何查询KO first打靶后的序列信息和示意图?
  • A:登录网站http://www.mousephenotype.org/,输入基因名称(以Acat3为例)进行查询

    查询结果如下:

    点击ES cells进入

     

  • 4Q:如何下载某基因的序列信息?
  • A:登录NCBI网站:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,下拉选择Gene,输入基因名称(以Acat3为例),点击search进行查询

    查询结果如下:

    Name/Gene ID下方选择点击Acat3进入,并找到Genomic regions,transcripts,and products项目,点击选择下方的Genebank:

    点击Genebank进入后即可下载该基因的序列信息。

  • 5Q: 图谱中的Frt是什么作用?是构建筛选ES细胞用的么?
  • A:FRT位点可以配合Flipase,和Flper小鼠(表达flipase)进行交配,去掉两个FRT位点之间的元件之后,可以转变为Exon被两个loxp位点包围的条件性敲除小鼠,把小鼠从全敲转变为条件性敲除。

  • 6Q:为什么ES细胞需要进行QC,QC检测的是什么?
  • A:我们获取到的可用克隆只是通过Production QC的克隆,一般只检测loxp,lacZ,LOA等几项,这些通过不代表打靶完全正确;并且在ES细胞传代中,可能出现染色体拷贝数的变异,会影响到ES细胞进入生殖系遗传到后代的效率。QC的目的在于从细胞水平上尽量提高能够获得正确敲除小鼠的概率。QC其中一部分检测是确定打靶载体是否完整整合到细胞基因组中,我们检测了lacZ,loxps(loxp1-3,取决于具体的载体),LA(5’LA和3’LA)位点,前四个位点的鉴定是确认这些位点是否存在,载体功能是否完整;LA的鉴定是为了确认载体是否正确整合到目标位置。另外会检测4条染色体,Chr8、ChrY、Chr1和Chr11的拷贝数(copy number),这四条染色体拷贝数对ES细胞GLT效率有极大影响,依据现有数据,Chr8,ChrY fail几乎不能获得GLT的后代。

  • 7Q:同一个基因的克隆号后三位不同,代表什么意思?
  • A:不同ES克隆的图谱是一样的,属于电转打靶后获得的不同细胞克隆,选取多个克隆是为了保证获得QC正确的克隆。

  • 8Q:如何解读Copy Number的结果?
  • A:Copy number的检测是通过荧光定量的方法,以野生型的ES细胞作为对照,使用特定的探针对待检测的几条染色体进行拷贝数定量。正常情况下,常染色体拷贝数为2,性染色体拷贝数为1。根据IKMC及我们之前的经验,染色体拷贝数的异常,会大大降低ES细胞进入生殖系遗传到后代的几率,特别是Chr1,8,11,Y四条染色体。但是此检测方法存在一定误差,+判断pass的标准。一般优先使用Copy数全部通过的克隆,如果均没有通过,Chr1,Chr11 fail,Chr8,ChrY通过的也可进行下尝试。

     

  • 9Q:如何挑选ES细胞克隆?
  • A:如果您对于挑选克隆不是很清楚,可以直接提供基因名称、MGI No.或者其他能让我们确定基因的信息,我们会在基因库中查询该基因是否在本中心存有ES克隆,同时根据IKMC已有的QC信息对克隆进行优先排序,推荐几个克隆进行后续工作。按照目前我们的整体通过率(克隆通过率约70%),推荐3个克隆,会获得较好的项目完成度。

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