Knockout First (KO First)打靶策略不同于一般的敲除设计，能实现多用途的基因敲除。在靶片段(Critical Region)的两侧放置方向相同的loxp位点，同时在靶片段5’端内含子中放置一个两侧带有FRT位点的SA-IRES-lacZ片段，含有Splice acceptor(SA)，核糖体结合位点 IRES，报告基因lacZ和抗性筛选标记Neo。其基因转录会在SA的作用下改变，转录出lacZ的部分,并在polyA处终止，因此其最初是一个不表达的状态，并且可以用靶基因的启动子表达报告基因(lacZ)，通过检测报告基因的表达即可了解靶基因的表达情况。与表达Flp的工具鼠交配后可去除SA-IRES-lacZ片段，得到常规的flox小鼠 ，从而还原已敲除基因的表达，获得基因条件性敲除小鼠，与不同组织特异性的Cre交配后即可用于更精细的研究。

KO First打靶载体示意图如下:

KO First载体正确打靶后得到的就是Conditional ready的ES细胞，是具有成为条件性打靶潜力的，但是，在打靶载体发生同源重组时，有时会错误的发生在载体中的Critical Region部分，位于打靶载体3’远端的loxp就会因此丢失。

这种情况称为Targeted，Non-conditional，其最远端的loxp缺失，lacZ仍可以标示基因表达情况, 并且在大部分情况下仍能够破坏基因表达，但是在Flp重组后无法转换成条件性敲除的形式。

可以直接由中心首页(https://www.cam-su.org/)的资源库检索界面按基因名及MGI号进行检索，

找到基因后点击 查看详细的克隆信息（  代表已有QC结果）

我们展示细胞克隆的打靶载体示意图，并提供序列下载。

登录NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下拉选择Gene，输入基因名称（以Acat3为例），点击search进行查询

查询结果如下：

Name/Gene ID下方选择点击Acat3进入，并找到Genomic regions，transcripts，and products项目，点击选择下方的Genebank：

点击Genebank进入后即可下载该基因的序列信息。

QC的目的在于从细胞水平上尽量提高能够获得正确敲除小鼠的概率。我们会检测 lacZ，loxps(loxp1-3，取决于具体的载体)这几个重要的位点，5’LA和3’LA鉴定来确认载体是否正确整合到目标位置。另外会检测4条染色体，Chr8、ChrY、Chr1和 Chr11的拷贝数(copy number)，这四条染色体拷贝数对ES细胞GLT效率有极大影响 。