小鼠 | Mouse

  • 1Q:如何区分tm1a,tm1c,tm1d,tm1b和tm1e?
  • A:

    “Knockout First” allele(tm1a)是在目的基因内含子中插入一个SA-IRES-reporter片段(含有报告基因lacZ和一个启动子驱动的Neo),lacZ的转录在SA的作用下受目的基因启动子控制,并在polyA处终止,从而达到终止目的基因转录、破坏基因表达的目的。Flp的表达可以删除SA-IRES-reporter片段,将tm1a转变成conditional allele(tm1c),删除SA-IRES-reporter片段,从而恢复基因功能。在tm1a的基础上,Cre的表达可以删除Neo和Critical Region从而变成lacZ标记的Allele(tm1b)同时敲除基因;在tm1c的基础上,Cre的表达可以删除tm1c allele上的Critical Region而变成移码突变的tm1d,从而使该基因不表达。而tm1e是由于基因打靶时发生错误而成,本应在3’同源臂进行重组,却错误的在Critical Region的位置进行了重组,从而丢掉了3’远端的loxp。

    各种形式的示意图如下:

     

     

  • 2Q:为什么获得的F1小鼠毛色,有黑(Black)有灰(Agouti)?
  • A:

    细胞库中ES细胞的来源是C57BL/6N,在构建细胞库时使用了不同的亚系,对应毛色如下表 :

    如果细胞来源的毛色是Agouti(A/a),那么与C57BL/6N Black(a/a)交配获得的后代中就可能出现Agouti(A/a)/Black(a/a)两种毛色,而如果细胞来源的毛色Black(a/a)则只会有黑色Black(a/a)的后代。

     

  • 3Q:接收到小鼠后,需要做哪些鉴定?
  • A: 小鼠在移交之前,我们会进行完整的QC,具体结果会呈现在鉴定报告中。如果您需要对结果进行复核,可以按照报告中的方法对各位点进行鉴定。确认获得可稳定遗传的F1代阳性小鼠后,您只需使用报告中的一对基因特异性引物,即可完成后代小鼠的鉴定。

     

  • 4Q:接收到小鼠后该如何繁育?
  • A:

    我们资源库中小鼠突变ES细胞来源是JM8及其亚系,来源于C57BL/6N,因此移交的F1原则上应该与C57BL/6N背景的鼠交配繁育后代。当然也可以通过多代的回交来更换品系背景。

    如果您获得的是全敲小鼠(tm1a+/-),应根据获得的小鼠数量及后续实验预估使用量来制定合理的繁育计划,如果小鼠数量不足应先与C57BL/6N扩繁一代(建议繁殖笼内雄雌比为1:2)。在获得足够数量的tm1a+/-后,可将tm1a+/-自交获得tm1a-/-;如果您想做条件敲除,首先应将tm1a+/-与flper配繁获得tm1c+/-小鼠,再使用该小鼠与您感兴趣的cre工具鼠配繁获得tm1d小鼠。值得注意的是,由于SA-IRES-reporter片段较长、删除不彻底,可能会导致tm1c中嵌合有tm1a(详细说明参见小鼠FAQ9:为什么得到的tm1c+/-可能会嵌合tm1a),所以获得的第一代tm1c+/-应与C57BL/6N小鼠进行配繁,对后代进行鉴定,筛选出tm1c阳性、Flp阴性的小鼠再进行后续繁育工作。

    您也可以直接在本中心订购tm1c+/-小鼠,我们默认移交给您的为tm1a与FLPeR工具鼠配繁后获得的第一代tm1c阳性小鼠,该小鼠同样需要先与C57BL/6N(J)小鼠配繁一代,筛选到tm1c阳性、flp阴性的子代后再使用该子代进行后续配繁。

     

  • 5Q:如何保障顺利配繁?
  • A:

    (1) 选取适龄小鼠进行配繁,年龄过大(>8个月)或过小(<6周)均会影响到繁育的效果。

    (2) 在合笼时检查小鼠生殖器,有时小鼠生殖器发育异常会导致不育,比如雌鼠可能是双阴道,雄鼠可能睾丸萎缩等问题。

    (3) 合笼后应保障营养供给,应选择配方营养全面的饲料或额外补充些花生、瓜子。

    (4) 定期检查是否有生崽的迹象,比如做窝纸上是血迹,说明有过新生小鼠。新生小鼠的夭折可能是母鼠食崽现象,食崽现象经常出现在第一窝。为了避免食崽现象,应调控好鼠房温湿度、光照、噪音等影响因素。

    (5) 如果配繁1.5-2个月仍无后代出生的繁殖笼,可以尝试更换雌鼠或雄鼠。

    (6) 以上方法都尝试过后,仍然没有出生,可通过体外受精(IVF)获得小鼠。

     

  • 6Q:如何鉴定tm1c小鼠?
  • A:

    可根据片段删除后的基因组设计引物来鉴定,一般我们所用的引物设计位点示意图如下:

    一般情况下,tm1c allele与WT allele的PCR产物大小不同,用一对引物即可进行鉴定,同时需要考虑该引物在tm1a allele上的产物大小,鉴定时最好带上tm1a作为对照。

     

  • 7Q:是否可以用tm1a的引物来鉴定tm1c小鼠?
  • A 不能。鉴定tm1a的引物其中一侧位于FRT删除的区域之内,在tm1c上没有结合位点,不能用于tm1c的鉴定,因此需要重新设计一对针对tm1c的引物。

     

  • 8Q:条件性敲除(tm1c,Flox)小鼠是如何获得的?
  • A: 在获得tm1a(+/-)的小鼠后,与Flper小鼠(如Gt(ROSA)26Sortm1(FLP1),或其他表达FLP1的小鼠)交配,在后代Flp/+的小鼠中,能够使tm1a(+/-)的两个FRT位点之间的片段发生删除(最终保留一个Frt位点),产生tm1c(+/-),即Flox/+。

     

  • 9Q:Flp如何鉴定?
  • A:

    tm1c小鼠鉴定所需使用的引物序列及反应条件如下

    引物名称

    -

    Sequence

    Size

    flpmtF

    MT

    CACTGATATTGTAAGTAGTTTGC

    725bp

    flpmtR

    CTAGTGCGAAGTAGTGATCAGG

    •                             PCR条件:57 30′ 72 45′

    引物名称

    -

    Sequence

    Size

    Flper-F

    WT

    CCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

    383bp

    Flper-R

    TGACTACCTATCCTCCCATTTTCCT

    •                             PCR条件:57 30′ 72 30′
    • 结果判定:
    • Flper杂合:WT阳性,MT阳性
    • Flper纯合:WT阴性,MT阳性
    • WT WT阳性,MT阴性

     

  • 10Q:为什么得到的tm1c+/-可能会嵌合tm1a?
  • A: 由于KO-first打靶策略中两个frt位点间删除的片段较长,可能会出现frt的删除效率达不到100%的情况,因此首次获得的tm1c+/-小鼠中会混有tm1a allele。在这种情况下,如果 tm1c+/-(嵌合)与tm1c+/-(嵌合)自交获的后代中,可能会有tm1a向下遗传,Flp也会遗传到下一代,造成下一代的基因型十分复杂。尤其是鉴定tm1c的引物不能识别tm1a allele,例如tm1c-/tm1a-就会被错误识别成tm1c-/-,同时表现出后代比例不正常的情况。如果tm1a allele、tm1c allele以及Flp同时遗传到下一代的某只鼠中,那么基因型将更为复杂,不能通过普通鉴定确定基因型。为避免出现这种情况干扰后期繁育及鉴定,建议在首次获得tm1c小鼠后与C57BL/6N(J)配繁一代,筛选出tm1c+/-且flp wt/wt的子代小鼠(纯的tm1c+/-)才可以进行后续的繁育。

     

  • 11Q:组织特异性Cre小鼠与tm1c小鼠交配后的鉴定?
  •  A: 组织特异性Cre能够在Cre表达的组织中特异性的将tm1c转变成tm1d,常用的提取DNA进行鉴定的组织(如脚趾或尾尖),可能因为Cre不在这表达,所以检测不到tm1d,此时应该同时鉴定Cre与tm1c。

     

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