KO first | KO first

  • 1Q:如何认识tm1a,tm1c,tm1d,tm1b和tm1e?
  • A:“knockout first”allele(tm1a)是在原基因内含子中插入一个IRSE片段(含有报告基因lacZ和一个启动子驱动的neo),从而破坏基因的功能。Flp的表达可将knockout first allele转变成conditional allele(tm1c),从而恢复基因功能。Cre的表达可以删除启动子驱动的筛选标记和tm1a allele上的外显子从而变成lacZ标记的Allele(tm1b)或者直接删除tm1c allele上的外显子而变成移码突变的tm1d,从而使该基因不表达。

    tm1a,tm1c,tm1d,tm1b以及tm1e是对由Knockout-first打靶策略产生的不同Allele形式的命名,tm1表示第一次打靶(也有tm2,表示第二次打靶),a,b,c,d,e表示不同的Allele Type。各种形式的示意图如下:

    (1)tm1a,tm1c,tm1d,tm1b

    (2)tm1e

    在对小鼠进行基因型标注时,先写明Allele Type,然后一般(+)表示WT Allele,(-)表示基因改造过的Allele。例如tm1a(+/-)指该小鼠的打靶基因中一个Allele为tm1a,另外一个Allele为WT;tm1a(-/-)表示该小鼠为纯合的tm1a。同样,tm1c(+/-)指该小鼠为杂合的tm1c(也可以标注为Flox/+);tm1c(-/-)表示该小鼠为纯合的tm1c,即Flox/Flox。

  • 2Q:为什么获得的F1小鼠会有不同的毛色,有黑有灰?
  • A:细胞库中ES细胞的来源是C57Bl/6N,在构建细胞库时使用了不同的亚系,如JM8,其中几个亚系对细胞的毛色基因进行了修正,将野生型aaBBCC(Black)修改为AaBBCC(Agouti),因此获得founder毛色存在两种状态,黑色和灰色,可以通过克隆的背景信息获取。与B6N(aaBBCC(Black))交配后的F1就可能是 AaBBCC(Agouti)和aaBBCC(Black),因此F1的小鼠可能是黑色或灰色。同理,如果founder是aaBBCC(Black),那么出生的小鼠就只能是黑色。

  • 3Q:从ES细胞开始需要多久能够获得敲除小鼠(tm1a)?
  • A:ES细胞复苏和QC一般35个工作日可以完成;安排注射到founder出生大约1个月时间;founder会在6-8周时繁育,如果顺利的话,一个月之后可以拿到F1,F1的QC需要两周时间。

  • 4Q:您拿到KO first F1小鼠之后,需要做哪些鉴定?
  • A:理论上,KO first F1(tm1a)小鼠在移交之前,我们已经做了QC,鉴定报告中会具体呈现。如果您需要确认我们给的小鼠是否正确,可以按照鉴定报告中的方法进行鉴定。鉴定报告中有一对引物是基因特异性的,可以用于后代小鼠的鉴定,需要注意的是,该引物只能用于tm1a的鉴定,鉴定结果中WT和KO的条带同时出现时,小鼠为tm1a+/-基因型;只有WT条带出现时,小鼠为WT;只有KO条带出现时,小鼠为KO纯合鼠(tm1a-/-)。

  • 5Q:条件性敲除(tm1c,Flox)小鼠是如何获得的?
  • A:在获得tm1a(+/-)的小鼠后,与Flper小鼠(品系名称)交配,在后代Flp+的小鼠中,能够使tm1a(+/-)的FRT位点之间的片段发生删除(最终保留一个Frt位点),产生Tm1c(+/-),即Flox/+。需要注意的是,在KO-first载体中,FRT之间序列较长, Flp删除效率很可能无法达到100%,因此首次拿到的tm1c小鼠可能出现嵌合的情况,即该小鼠体内tm1a和tm1c可能同时存在,所以需要再与背景品系回交从而分离出tm1c allele。具体做法为:将tm1a+/-小鼠必须与野生型小鼠先进行交配繁育一代,从而去除基因组中的Flp和tm1a(Flp阴性且tm1c阳性),筛选出纯的tm1c(+/-)之后,才能进入下一步繁育。

  • 6Q:为什么得到的tm1c+/-可能是不纯的?
  • A:由于KO-first打靶策略中两个frt位点间删除的片段较长,可能会出现Flper删除frt的效率不高,达不到100%,因此首次获得的tm1c+/-小鼠中会混有tm1a allele。在这种情况下,如果 tm1c+/-(不纯)与tm1c+/-(不纯)自交获的后代中,可能会有tm1a向下遗传,Flp也会遗传到下一代,造成下一代的基因型十分复杂。这时,鉴定tm1c的引物不能识别tm1a allele,如tm1c-/tm1a-就会被错误识别成tm1c-/-,同时表现出后代比例不正常的情况。如果tm1a allele、tm1c allele以及Flp同时遗传到下一代的某只鼠中,那么基因型又更为复杂,不能通过普通鉴定确定基因型。

     

    为排除这种情况发生,干扰后期繁育及鉴定,建议在首次获得tm1c小鼠后先与野生型小鼠交配一代,鉴定结果为tm1c阳性且flp阴性的小鼠(纯的tm1c+/-)才可以进行后续的繁育。

  • 7Q:如何鉴定tm1c小鼠?
  • A:可根据片段删除后的基因组设计引物来鉴定,一般我们所用的引物设计位点示意图如下:

    用一对引物即可进行鉴定,Tm1c Allele与WT Allele的PCR产物大小不同,即可区分出tm1c和WT。

  • 8Q:从中心获得的tm1c(flox)小鼠与WT交配后,如何鉴定Flp?
  •  A:

    引物名称

    -

    Sequence

    Size

    flpmtF

    MT

    CACTGATATTGTAAGTAGTTTGC

    725bp

    flpmtR

    CTAGTGCGAAGTAGTGATCAGG

    PCR条件:57℃ 30′72℃ 45′

          

    引物名称

    -

    Sequence

    Size

    Flper-F

    WT

    CCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

    383bp

    Flper-R

    TGACTACCTATCCTCCCATTTTCCT

    PCR条件:57℃ 30′72℃ 30′

    结果判定:

    Flper杂合:WT阳性,MT阳性

    Flper纯合:WT阴性,MT阳性

    WT:      WT阳性,MT阴性

  • 9Q:是否可以用tm1a的引物来鉴定tm1c小鼠?
  •  A 不能。鉴定tm1a的引物一侧位于FRT删除的区域之内,在tm1c上没有结合,不能用于tm1c的鉴定,需要重新设计针对tm1c的引物。

  • 10Q:如果注射拿到阳性F1小鼠,可以直接和 Cre小鼠交配获得条件性敲除小鼠了吗?
  •  A 现在我们中心库里的细胞一般都是KO First的打靶策略,如下图:

    得到F1小鼠默认是全敲的(杂合子),因为Exon2之后加了一个人工Exon将基因表达提前中止,并带LacZ报告基因。和FLPer小鼠(表达flipase)进行交配,去掉两个FRT位点之间的元件之后,可以转变为Exon3被两个LoxP位点包围的条件性敲除小鼠,然后才可以使用Cre小鼠进行特异性敲除。

  • 11Q:组织特异性Cre小鼠与tm1c小鼠交配后的鉴定?
  •  A 如果Cre是组织特异性的,与tm1c小鼠交配后获得tm1d,但由于Cre是组织特异性的,因此有可能在尾巴处的细胞基因组还是tm1c,因此不能用tm1d的引物进行鉴定,需同时鉴定Cre与tm1c即可。

  • 12Q:从本中心获得的tm1c小鼠是否可以直接与Cre鼠交配获得条件性敲除小鼠?
  •  A 不能。第一代获得的tm1c小鼠Frt删除不完全,处于嵌合状态,如果直接与Cre进行交配,可能会有tm1a遗传下来,影响到后面的鉴定确认。

  • 13Q:拿到小鼠后如何繁育?
  •  A 我们小鼠的细胞来源是JM8及其亚系,来源于C57BL/6N,因此拿到的F1原则上应该与B6N背景的鼠交配繁育下一代。如果需要使用其他背景的话,需要通过多代的回交来更换品系背景。

    (1)如果拿到的鼠是tm1a+/- : 我们给您移交的鼠数量不多,要根据您的实验要求来制定合理的繁育计划,首先跟野生型小鼠B6N交配扩繁(具体扩繁的笼位数量跟您预期后代的数量和比例拟定),获得足够数量的tm1a+/- 。后续根据您的实验要求,若要得到tm1a-/-,则将tm1a+/-自交;若要得到tm1c+/-,则将tm1a+/-跟flper交配。为确保得到的是纯的tm1c+/-,要先与野生型鼠交配,鉴定得到纯的tm1c+/-以后再进行您后续的实验。

    (2)如果拿到的鼠是tm1c+/- : 首先为确保是纯的tm1c+/-,要先跟野生型鼠交配,鉴定得到纯的tm1c+/-以后再进行您后续的实验。

  • 14Q:如何获得纯合的KO鼠?
  •  A F1与B6N交配后所得到的后代的基因型是+/-,繁育拿到的足够数量的基因型为+/-的小鼠后,用同为+/-基因型的雌鼠和雄鼠进行交配,即可获得KO纯合(-/-)的基因敲除鼠。具体合笼的数量根据实验需要的小鼠数量和年龄来决定。

  • 15Q:配了很长时间生不出怎么办?
  • A:

    (1)经常定期检查,看是否有生过的迹象,比如做窝纸上是否有血,如果有说明是可以生的,可以再稍微等一段时间。

    (2)更换雌鼠或者雄鼠,看是否有出生,检查雌鼠或雄鼠是否不育。

    (3)饲料营养可能达不到,孕育期间可给雌鼠补充营养,比如加点瓜子或者花生。

    (4)检查小鼠生殖器,有时小鼠生殖器发育异常回家导致不育,比如雌鼠可能是双阴道,雄鼠可能睾丸萎缩等问题。

    (5)确认小鼠的年龄,超过8个月的鼠一般生育情况不好,尤其是基因改造过后的小鼠可能会对生殖有影响,加上年龄过大就很难繁育了。一般在8周左右的鼠是繁育的最好阶段。

    (6)以上方法都试过后,仍然没有出生,可通过 IVF进行体外受精获得小鼠。

联系我们

剑桥-苏大基因组资源中心
Email: office@cam-su.org
详细地址: 苏州市工业园区仁爱路199号703楼3126室

Copyright: 剑桥-苏大基因组资源中心
苏ICP备-10229414
技术支持: 南京百迈斯信息科技有限公司

扫一扫关注我们的公众号